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動物実験代替安全性試験プロトコル集    
【付録CD-ROM】付
The Protocols for the Alternative Toxicological Testings
[コードNo.2013S779]

※ 本書籍はご試読頂けません ※

■監修/ 小島肇夫
■体裁/ B5判 275ページ、付録CD-ROM付
■発行/ 2013年5月20日 (株)シーエムシー出版
■定価/ 73,440円(税込価格)
■ISBNコード/ 978-4-7813-0792-3

 
★OECDテストガイドライン収載、またはバリデーション中の試験法を多数掲載 !!
★試験原理をはじめ、試薬調整、細胞培養など実際の手技を詳細に解説 !!
★試験のデータ解析に欠かせないデータシート見本収載のCD付!!!

キーワード

動物実験代替法 / JaCVAM / GHS / 光毒性試験 / 皮膚感作性試験 / 皮膚刺激性試験 / 眼刺激性試験 / 遺伝毒性試験 / 急性毒性試験 / コロニー形成法 / 内分泌撹乱物質スクリーニング / がん原性物質のスクリーニング / 統計学

刊行にあたって

動物実験は医学・生理学の発展に大きな役割を果たすとともに、現在も人類の健康と福祉に大きく貢献しております。しかし、近年、動物実験の3Rs(Reduction : 動物実験の削減、Refinement : 実験動物の苦痛の軽減、Replacement : 動物実験の置換え)の観点から、動物実験代替法(3Rs原則を実現する試験法)の活用に向けた取り組みが世界中で行われています。特にEUでは早くからこうした動きが盛んであり、2013年3月より、動物実験を行った成分を含む化粧品の製造販売を禁止されるなど、国際化が進む中、わが国の関連企業へも大きな影響を及ぼしています。

このため、動物実験代替法にて人類の健康と福祉を確保するためには、「行政的に認められた動物実験代替法」の普及が急務となっています。しかしながら動物実験代替法に関する詳細な実験書はなく、英語で書かれた論文やOECD(経済協力開発機構)のテストガイドラインを参考にし、各社でアレンジした手法で試験をせざるをえないのが現状のようです。

こうした背景から、「動物実験代替安全性試験プロトコル集」を企画いたしました。本書籍は、各分野の専門家にOECDテストガイドラインとして承認済み、または承認間近の試験法をプロトコル形式で解説頂き、まとめて頂いたものです。

また本書籍には、試験の際に実際に使用されている「データシート」を収載したCDを付与しました。これらのデータシートを試験実施の際に使用して頂くことで、動物実験代替法の更なる普及にもつながると考えております。よろしくご利用頂けましたら幸いです。

(本書「はじめに」より)

著者一覧

小島肇夫国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター 薬理部 新規試験法評価室 室長
森田健国立医薬品食品衛生研究所 安全情報部 室長
尾上誠良静岡県立大学 薬学部 薬物動態学分野 准教授
若栗忍(一財)食品薬品安全センター 秦野研究所
五十嵐良明国立医薬品食品衛生研究所 生活衛生化学部 部長
山下邦彦(株)ダイセル 研究統括部 コーポレート研究所 評価・解析グループ 主席研究員
篠田伸介(株)薬物安全性試験センター 吉見研究所 第三試験室 室長
丸山裕子富士フイルム(株) CSR推進部 環境・品質マネジメント部 安全性評価センター
宮澤正明花王(株) 安全性科学研究所
加藤雅一(株)ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング 研究開発部 主幹研究員
半田由希倉敷紡績(株) バイオメディカル部 バイオ試薬課
山本直樹藤田保健衛生大学 共同利用研究施設 分子生物学 准教授
吉村功東京理科大学 名誉教授
榊原隆史(株)化合物安全性研究所 安全性研究部 第四研究室 副主任研究員
六川潤美(株)化合物安全性研究所 安全性研究部 病理検査室 副主任研究員
小坂忠司(一財)残留農薬研究所 試験事業部 業務担当部長
額田祐子花王(株) 安全性科学研究所 研究員
宇野芳文田辺三菱製薬(株) 研究本部 安全性研究所 第一部長
武藤重治田辺三菱製薬(株) 研究本部 安全性研究所 主任研究員
本間正充国立医薬品食品衛生研究所 変異遺伝部 部長
橋祐次国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター 毒性部 主任研究官
渡辺美香(一財)食品薬品安全センター秦野研究所 代替法試験部 細胞毒性学研究室 室長補佐
赤堀有美(一財)化学物質評価研究機構 安全性評価技術研究所 主任
武吉正博(一財)化学物質評価研究機構 安全性評価技術研究所 研究第一部長
小野敦国立医薬品食品衛生研究所 総合評価研究室 主任研究官
酒井綾子(一財)食品薬品安全センター 代替法試験部 細胞発がん研究室
大森崇同志社大学 文化情報学部 准教授

構成および内容

【第I編 動物実験代替法概論】

第1章動物実験代替法の意義と今後  (小島肇夫)
1はじめに
2動物実験に関する各国の状況
2.1EU
2.2米国の状況
3国際機関
3.1日米EU医薬品規制調和国際会議(ICH:International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)
3.2化粧品国際規制会議(ICCR:International Cooperationon Cosmetics Regulations)
3.3経済協力開発機構(OECD:Organisation for Economic Co-operation and Development)
3.4国際標準化機構(ISO:International Organisation for Standardization)
3.5国際獣疫事務局(OIE:World Organisation for Animal Health)
3.6バリデーションセンター
4おわりに
第2章GHSにおける代替法の基準および規制の動向  (森田健)
1GHSとは
2GHSにおけるハザードコミュニケーション
3GHSにおける健康有害性項目とOECDテストガイドライン
4わが国のGHS導入状況と今後の対応

【第II編 安全性試験法解説】

〈光毒性試験〉
第1章Reactive Oxygen Species(ROS)アッセイ  (尾上誠良)
1はじめに
1.1光線過敏症
1.2化合物の光化学反応性と光毒性誘発リスク
2材料および試薬
2.1試薬
2.2器具・機器
2.3その他に必要とされる器具・装置
3測定原理
4試験方法ならびにデータ解析
5データ採用条件
6陽性基準
7適用限界
第2章In vitro 3T3 NRU phototoxicity test  (若栗忍)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2試薬
2.3器具・機器
2.4その他
3試験方法
3.1照射条件の設定
3.2細胞の紫外線感受性
3.3試験に供試する被験物質の条件
3.4被験物質の調製
4光細胞毒性試験
4.11日目
4.22日目
4.33日目
4.4データ解析
5試験成立のための条件
6試験における判定基準
7適用限界
8その他の注意事項
〈皮膚感作性試験〉
第3章Local Lymph Node Assay(LLNA)  (五十嵐良明)
1はじめに
2材料および試薬
2.1動物
2.2試薬
2.3器具・機器
3試験方法
3.1予備スクリーニング試験
3.2本試験のスケジュール
3.2.1第1日
3.2.2第2日および第3日
3.2.3第4日および第5日
3.2.4第6日
3.2.5第7日
4データ採用条件
5陽性基準
6その他の注意事項
6.1Local Lymph Node Assay(LLNA)
6.2Reduced local lymph node assay(rLLNA)
第4章LLNA:DA  (山下邦彦、篠田伸介)
1はじめに
1.1試験法開発の経緯と特徴
1.2試験の概要および本書記載の試験方法の注意点
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2試薬
2.3器具・機器
3試験方法
3.1予備試験
3.1.1被験物質の調整
3.1.2溶媒
3.1.3投与
3.1.4観察
3.1.5本試験に用いる濃度
3.2本試験
3.2.11日目
3.2.22日および3日目
3.2.37日目
3.2.48日目
4試験結果の判定〜データの採用条件および信頼性チェック〜
5判定基準
6適用限界
7その他の注意事項
第5章LLNA: BrdU-ELISA  (丸山裕子)
1はじめに
2材料および試薬
2.1使用動物
2.2試薬
2.3機器、器具
2.4その他試薬、消耗品
3試験方法
3.1動物飼育
3.2調製
3.2.1被験物質
3.2.2陽性対照物質
3.3予備試験
3.3.1被験物質液の耳介への塗布
3.3.2観察・測定
3.3.3主試験の用量設定
3.4主試験
3.4.1群構成
3.4.2感作
3.4.3BrdU投与
3.4.4耳介リンパ節の採取
3.4.5BrdU取り込み量の測定
3.4.6結果の評価
4データ採用条件
5陽性基準
6適用限界
7その他の注意事項
第6章human Cell Line Activation Test(h-CLAT)  (宮澤正明)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2フローサイトメトリー測定用試薬
2.3機器
3試験方法
3.1細胞および機器の準備
3.1.1細胞の維持
3.1.2試験前の細胞準備
3.1.3試薬および器具の使用にあたっての注意点
3.1.4フローサイトメトリーの設定
3.1.5細胞の反応性確認
3.2濃度設定試験(細胞毒性試験)
3.2.11日目の方法:被験物質の調製および細胞処理
3.2.22日目の方法:細胞回収、フローサイトメトリー測定
3.2.3CV75の測定と本試験の濃度設定
3.3本試験(CD86およびCD54測定試験)
3.3.11日目の方法:被験物質の調製および細胞処理
3.3.22日目の方法:細胞回収、細胞染色
3.3.32日目の方法:フローサイトメトリー測定
4データ採用条件
4.1データ解析
4.2試験成立の条件
4.3各被験物質における試験データの採用基準
5陽性基準
6EC150、EC200の算出
6.1EC150あるいはEC200を挟む2濃度が得られている場合(内挿法)
6.2試験最低濃度がCD86またはCD54の陽性基準値を超えている場合(外挿法)
7適用限界
〈皮膚刺激性試験〉
第7章LabCyte EPI-MODEL24皮膚刺激性試験  (加藤雅一)
1はじめに
1.1背景
1.2試験法の原理
1.3試験法の概要
1.4LabCyte EPI-MODEL24
2材料および試薬
2.1LabCyte EPI-MODEL24の構成
2.2試薬
2.3機器
2.4その他
3試験方法
3.1LabCyte EPI-MODEL24の前培養
3.2被験物質の適用と洗浄
3.3後培養
3.4MTT反応
3.5MTTフォルマザンの抽出と測定
4試験の成立基準
4.1試験適合基準1:陰性対照
4.2試験適合基準2:陽性対照
4.3試験適合基準3:標準偏差(SD)
5予測モデル
6適用限界
7その他の注意事項
第8章皮膚刺激性試験(EpiDerm、in vitro)  (半田由希)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2試薬
2.3機器・器具
2.4その他
3試験方法
3.1―0日目― プレインキュベーション
3.2―1日目― 試験物質曝露
3.3―2日目― 培地交換
3.4―3日目― MTTアッセイ
3.5試験データ
4試験成立条件
5陽性基準
6適用限界
6.1蒸発性の高い試験物質
6.2MTTに干渉する可能性のある試験物質
7その他の注意事項(ナイロンメッシュの適合性(液体試験物質限定))
〈眼刺激性試験〉
第9章フルオレセイン漏出試験法(Fluorescein leakage test method ; FL試験法)  (山本直樹、吉村功)
1はじめに
1.1背景
1.2試験法の位置づけ
1.3試験法の概要
2材料および試薬
2.1使用細胞
2.2試薬
2.3試薬調整
2.4器具・機器
3試験方法
3.1インサート上での細胞層の形成
3.2被験物質の準備と曝露
3.3蛍光物質(Na-F)の添加と測定
3.4結果解析
4データ採用条件
5陽性基準
6適用限界
7その他
7.1試験の実施における注意点
7.2試験法の正確性
7.3試験結果の再現性について
8結論
第10章眼腐食性および強度刺激性物質を同定するためのウシ角膜を用いる混濁度および透過性試験法  (榊原隆史、六川潤美)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料(ウシ眼球)
2.2試薬
2.3器具・機器
3試験方法
3.1眼球の準備
3.2被験物質の適用
3.3暴露後のインキュベーション
3.4対照物質
3.5測定評価項目
4データ採用条件
5陽性基準
6適用限界
7その他の注意事項
7.1病理組織標本の作製
7.2ウシ眼球および角膜の処分方法
第11章眼刺激性試験(サイトセンサーマイクロフィジオメーター法)  (小坂忠司)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料(細胞)
2.2培地
2.3機器
3試験方法
3.1L929細胞の準備
3.2被験物質および対照物質の適用
3.2.1被験物質調製の準備
3.2.2予備試験(適用濃度確認試験)
3.2.3本試験
3.3被験物質暴露前の準備および暴露サイクル
4データ採取条件
5MRD50(metabolic rate decrement of 50%)の算出
6適応限界
7その他の注意事項
第12章Short Time Exposure(STE)試験  (額田祐子)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生体材料
2.2試薬
2.3器具・機器
3試験方法
3.1試験溶媒の選択
3.2細胞の前培養
3.3被験物質調製
3.4曝露・測定
3.5細胞生存率算出
4データ採用条件
5陽性基準
6適用限界
7その他の注意事項
〈遺伝毒性試験〉
第13章コメットアッセイ  (宇野芳文、武藤重治)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料(供試動物)
2.2試薬
3試験方法
3.1実験デザイン
3.2動物への投与
3.3体重測定および症状観察
3.4組織採取
3.5単細胞の調製
3.6スライド標本の作製
3.7細胞溶解(または細胞核溶解)
3.8アンワインディングおよび電気泳動
3.9スライド標本の中和および脱水
3.10DNAの染色、コメットの画像化および解析
3.11病理組織学的検査
3.12統計学的解析
3.13データおよび報告書作成
3.14資料の保存
4データ採用条件
5結果の評価および解釈
6適用限界
7その他の注意事項
第14章哺乳類細胞を用いたin vitro小核試験  (本間正充)
1はじめに
1.1本試験について
1.2最初に考慮すべき事項
1.3試験の概要
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2試薬
3試験方法
3.1細胞増殖性および細胞毒性の測定、ならびに試験用量の選択
3.2処理計画
3.3cytoB処理を行うリンパ球、初代細胞および細胞株
3.4cytoB処理を行わない樹立細胞株
3.5細胞培養の数
3.6細胞試料の回収、およびスライドの調製
3.7分析
3.8試験機関の習熟度の保証
4データおよび報告
5結果の評価および判定
6試験報告書
補遺
〈急性毒性試験〉
第15章急性毒性試験  (橋祐次)
1はじめに
1.1急性毒性試験の経緯
1.2TG420 固定用量法 Fixed Dose Procedure
1.3TG423 急性毒性等級法 Acute Toxic Class Method、ATC法
1.4TG425 上げ下げ法 Up-and-Down Procedure、UDP法
1.5OECDのTG
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2器具・機器
3試験方法
3.1動物種
3.2検疫、馴化および群わけ
3.3飼育条件
3.4被験物質投与液の調製
3.5給餌と飲水
3.6投与量の算出
3.7投与
3.8動物数および投与用量
3.9限度試験
3.10観察
3.11体重測定
3.12病理学的検査
4その他の注意事項
4.1被験物質の腐蝕性の確認
4.2初回投与量の選択について
4.3検査項目について
第16章コロニー形成法による細胞毒性試験  (渡辺美香)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2試薬
2.3器具・機器
3試験操作
3.1被験物質の調製
3.1.1原料化学物質の場合
3.1.2医療機器および医薬品容器の場合
3.2細胞播種
3.3処理
3.4固定・染色
3.5コロニー計測
4データ採用条件
5陽性基準
6判定基準
〈内分泌撹乱物質スクリーニング〉
第17章hERα-HeLa-9903細胞株を用いた化学物質のエストロゲンアゴニスト活性を検出するための安定的に形質転換したヒトエストロゲン受容体αを介した転写活性化試験   (赤堀有美、武吉正博)
1はじめに(試験の意義や特徴)
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2試薬
2.3器具・機器
3試験方法
3.196-wellプレートへの細胞の播種
3.2被験物質の希釈と被験物質の暴露
3.3化学発光の測定
3.4RPCMax、PCMax、PC10、PC50およびEC50の算出
3.4.1RPCMax、PCMax、PC10およびPC50の算出
3.4.2EC50の算出
4データ採用条件
5陽性基準
6適用限界
7その他の注意事項
第18章BG1Luc細胞を用いるエストロゲン受容体転写活性化試験法  (小野敦)
1はじめに
2材料および試薬
2.1生物材料
2.2試薬
2.3器具・機器
3試験方法
3.1細胞の準備
3.1.1培地および関連試薬の調整
3.1.2細胞の増殖
3.1.3アッセイ用細胞の前培養
3.1.4細胞の安定性
3.1.5細胞生存率の目視判定
3.2コントロールの準備
3.2.1ストック溶液の準備
3.2.2用量設定試験で用いる標準液の調整
3.2.3本試験で用いる標準液の調整
3.3被験物質の準備
3.3.1アゴニスト試験
3.3.2アンタゴニスト試験
3.4各試験施設における背景データベースの構築
3.5技術実証試験
3.6発光強度の測定
3.7用量設定試験
3.7.1プレートデザイン
3.7.2アゴニスト用量設定試験の評価
3.7.3アンタゴニスト用量設定試験の評価
3.8本試験
4試験結果の採用基準
4.1アゴニスト用量設定試験
4.2アゴニスト本試験
4.3アンタゴニスト用量設定試験
4.4アンタゴニスト本試験
5データ解析と陽性(陰性)判定基準
5.1データ解析
5.2用量設定試験
5.2.1アゴニストアッセイ
5.2.2アンタゴニストアッセイ
5.3本試験
5.3.1アゴニストアッセイ
5.3.2アンタゴニストアッセイ
5.4陽性(陰性)判定基準
5.4.1アゴニストアッセイ
5.4.2アンタゴニストアッセイ
5.5EC50/IC50の算出
5.6はずれ値の判定
5.7結果報告書
6適用限界
7その他の注意事項
〈がん原性物質のスクリーニング〉
第19章Bhas 42細胞形質転換試験  (酒井綾子)
1はじめに
1.12段階発がんと2段階細胞形質転換
1.2Bhas 42細胞とBhas 42細胞形質転換試験
1.36-ウェル法と96-ウェル法
2Bhas CTAの構成
3材料および試薬
3.1細胞
3.2培地
3.3試薬
3.4器具および装置
4準備
4.1培養
4.2細胞の凍結保存
4.3細胞の適性検査
4.4FBSの選択
4.5被験物質と溶媒
4.6被験物質の濃度
4.7陰性対照と陽性対照
5試験方法
5.1イニシエーション試験
5.1.1細胞増殖試験
5.1.2形質転換試験のための濃度設定
5.1.3形質転換試験
5.2プロモーション試験
5.2.1細胞増殖試験
5.2.2形質転換試験のための濃度設定
5.2.3形質転換試験
6結果の評価
6.1形質転換頻度の記録
6.2統計解析
6.3データ採用条件(許容基準)
6.3.1同時実施の細胞増殖試験
6.3.2形質転換試験
6.4結果の判定
7注意事項
〈統計学〉
第20章バリデーション研究におけるデータマネージメント  (大森崇、吉村功)
1はじめに
2データクリーニング
3間違いの事前防止
4実験実施委員会と計画書
5実験結果の再現性
6図表示の利用例
7GLP準拠について
8プロトコル変更について
9データの保存と公開



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